Fille d'un géologue, Florence Loiret-Caille passe son enfance en Indonésie. De retour en France, elle prend des cours d'art dramatique au conservatoire national de Saint-Germain-en-Laye, tout en faisant sa première apparition au cinéma en 1996 dans Seule, court métrage signé par un réalisateur prometteur, Erick Zonca. On l'aperçoit bientôt chez Martine Dugowson, Benoît Jacquot ou Michael Haneke
En 2001, Florence Loiret-Caille incarne l'employée d'hôtel qui se fait dévorer par Vincent Gallo dans le dérangeant Trouble Every Day de Claire Denis, une réalisatrice qu'elle retrouvera à plusieurs reprises. Au même moment, une belle complicité se noue avec le jeune Jérôme Bonnell, qui lui offre le rôle de la secrète et boudeuse Emma dans Le Chignon d'Olga